更新时间：2024-09-20 23:15
抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术，其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA 消减杂交技术。
通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA 片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA 片段，抑制非目的cDNA的扩增。该技术是Diatchenko 等1996年在抑制性PCR的基础上建立起来的cDNA消减杂交方法，它克服了DD法的假阳性较高和RDA法消减杂交轮次较多的缺点，十分适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。
抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR 反应为基础，将标准化测试cDNA 单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试cDNA 片段的5’末端，将测试和驱动进行两轮杂交。所谓抑制性PCR 是利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列片段扩增。
抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下。首先，将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA 样品反转录为cDNA，把含有目的基因的cDNA 称为测试(tester)，把参考cDNA 称为驱动(driver)，用同一种限制性内切酶Rsa I 切割，产生末端平头的片段，将测试cDNA 分为两份，每份连接不同的接头，即接头1(adaptor 1)和接头2(adaptor 2)。接头为双链脱氧核糖核酸 片段，且5’- 端均无磷酸基，这样保证只有接头中的长链可以与cDNA 的5’- 末端连接，两个接头含有可识别的序列. 接下来进行两次杂交。第一次杂交每个测试里加入过量驱动，然后变性、退火，根据杂交动力学第二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此测试cDNA与驱动cDNA相同片段大都形成异源双链分子，使得差异表达的单链分子得到富集。第二次杂交，将进行过首次杂交的两组样品不经变性而直接混合，只有剩下的经过消减并平均化了的差异表达的单链cDNA 可以重新结合为新的杂交体分子，这种杂交体分子两端带有不同的接头1和接头2，加入新鲜变性的驱动进行第二轮消减杂交，进一步富集差异表达的杂交体分子，并用DNA 酶补平末端，这样差异表达的测试序列- 杂交体分子5'- 和3'- 端就有了进行巢式PCR 所需的不同的退火位点。最后，进行两次PCR 反应，第一次PCR 只有两端连接有不同接头的双链cDNA 片段才得以指数扩增，而其他形式如一端有接头，而另一端无接头的只能线性扩增，没有引物结合点的不能扩增，还有两端为同一接头的形成袢状而无法获得指数扩增。利用巢式引物进行第二次PCR，富集差异表达的基因片段. PCR 产物可以被直接插入T 载体，或者利用接头1 上的NotI/SmaI/XmaI 位点和接头2R 上的EagI 位点进行定向克隆，或者接头与cDNA 连接处的RsaI 位点平端克隆。然后利用测序和杂交分析来分析差异表达的序列，或者用PCR 产物作探针来筛选脱氧核糖核酸 文库。