生物正交化学(一种活体细胞内进行的化学反应)

生物正交化学(bioorthogonal 化学)的概念由卡罗琳·贝尔托西（ Bertozzi）于2003年正式提出，指能够在活体细胞内进行的化学反应，它们能够在生物体内的生理环境中发生，与其中的各种反应互不干扰，不会受到其中各种生物分子的影响，并且也不会对生物体或目标生物分子造成损害。

生物正交化学具有高效、特异及无损活体的特征。该反应要求参与反应的官能团组合具有专一的选择性，需与生物体系内本身存在的各种官能团严格正交，不发生任何反应。常见反应类型主要有：施陶丁格反应、铜催化的叠氮化物炔烃环加成反应以及无铜催化的SPAAC反应。

生物正交化学在荧光成像、药物开发及药物传递、活体标记与示踪中等领域有一定应用。如运用荧光成像探针实现对细胞及动物体内的生物大分子的动态、可视化观察，为疾病的诊断与治疗提供了有力的方法。在活细胞中，蛋白质、糖类和脂质都可以被生物正交基团修饰。

定义

生物正交化学的概念由卡罗琳·贝尔托西于2003年正式提出，生物正交反应是一类能够在生物体环境系中尤其是在活体动物内进行、且不与周围其它生物化学过程相互干扰的化学反应。即在两个分子上进行的化学修饰都不影响其各自在生物体内的代谢，也不和其他分子结合。生物正交化学属于一类具有特殊要求的点击化学，即可以成功应用于生物活性体系内的点击化学反应。

反应特征及标准

反应特征

生物正交化学具有高效、特异、无损活体的特征：生物正交化学即使在复杂的生理条件下也具有优良的选择性，反应过程简单快速并且不会受体内其他成分的影响，不会产生毒副产物。

反应标准

生物正交化学要求参与反应的官能团组合具有专一的选择性，需与生物体系内本身存在的各种官能团严格正交，不发生任何反应；此外，生物正交反应体系应该简单高效，应能在生理条件下，使用极低的反应底物浓度时快速形成稳定的化学键接结构。具体标准如下：

常见反应类型

生物正交化学常见反应类型主要有：施陶丁格反应、铜催化的叠氮化物炔烃环加成反应以及无铜催化的SPAAC反应。

施陶丁格反应

施陶丁格反应是三芳基膦和有机叠氮化物之间发生的一种化学反应。经典的施陶丁格会产生不稳定的氮杂叶立德，其很容易就会发生水解。在新的施陶丁格反应中，卡罗琳·贝尔托西将甲基引入到三芳基膦分子中，通过分子内环化反应对氮杂叶立德进行捕获。由此生成的酰胺键使两种起始原料稳定地连接在一起，实现对细胞表面糖分子的选择性标记。但由于施陶丁格反应的速度太慢，无法实现成像。施陶丁格反应的缓慢速度导致必须注射大量的试剂来驱动反应进行，但这会导致未与目标分子结合的探针基团也会发光。

铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应

被称作“点击”化学的一价铜离子催化的叠氮-炔基环加成反应(CuAAC)是发展最早、应用最广的生物正交偶联反应之一。该反应所涉及的两个官能团体积小，因此两个分子的结合可能更为容易。对于需要标记的生物分子而言，其自然的生化过程也不会受到干扰。但这种方法也无法被立即应用于活体动物的成像，并且CuAAC反应会产生活性氧自由基进而阻碍了它在细胞、组织以及活体上的应用，同时产生的“活性氧”物种的浓度对细胞有害。研究人员发现如果加入一些配体（如TBTA和BTTES配体等），可以降低一价铜的毒性。

点击化学反应在原则上应具有高选择性、高产率和广泛的底物适用范围。虽然该点击化学反应的最初设计用途是有机合成，但如果点击反应所涉及到的官能团完全不会存在于所研究生物的细胞中（也就是所谓的正交），那么该点击化学反应会非常可能适合于这样的生物学应用。对于哺乳纲，叠氮化物和炔烃就属于这一类官能团。

无铜催化的SPAAC反应

高反应活性的环状炔烃被用于无铜催化的叠氮⁃炔环加成反应，即SPAAC反应。该类生物正交反应利用了环状炔烃本身的高环张力，无需铜催化剂的参与即可发生具有化学区域选择性的点击反应。线性炔烃中其Ｃ-Ｃ≡Ｃ的键夹角为180°，但环辛炔的环状结构将其Ｃ-Ｃ≡Ｃ的键夹角扭曲至了160°（环辛炔是能被分离出的分子内张力最大的炔烃），因此其能级更接近于反应中的过渡态。研究人员为了提高其反应速率，在环辛炔中添加了取代基。该反应实现了生物活体中的生物正交成像。在斑马鱼成像实验中，可以看到聚糖在细胞表面被标记，然后通过内吞作用被内化并被运输至细胞中的不同细胞器中。

其他反应

四连接反应是最快速的生物正交反应。四嗪与反式环辛烯分子间的连接反应不怕水，而且速度极快。哺乳纲的细胞中是天然不存在着两种官能团的，表明其具有生物正交的应用潜力。

环辛炔和硝酮之间的环加成，即所谓的应变促进的炔-硝酮环加成 (SPANC)。环硝酮与联芳基氮杂-的应变促进环加成环辛炔酮(BARAC) 以高达47.3 M-1 s-1的速率常数进行，这相当于相对于BARAC的反应速率提高了47倍。苄基叠氮化物菌株增强了14倍炔烃硝酮环加成(SPANC)。这种生物正交反应主要用于体外生物共轭。

在光诱导下，温和的四唑-烯环加成促进制备蛋白质纳米载体（PNC），同时保留抗肿瘤和抗病毒药物瑞西莫德（R848）的生物活性。

“双取代炔丙基/铜试剂”这一新型生物正交剪切反应, 结合非天然氨基酸定点插入技术实现了细胞膜表面受体-配体相互作用的

原位调控。

通过构建二芳基取代的悉尼酮，利用紫外光照射加速1,3-偶极中间体的生成，大大提高了中间体的活性，并进一步和烯烃发生

[3＋2]环加成反应。1,3-偶极环加成的生物正交体系，实现了活细胞中不同多肽以及蛋白质的偶联标记。

苯乙烯酮-二苯并[a]芘环辛炔和降冰片烯-四嗪环的生物正交反应可用于同时对两种蛋白质进行高选择性荧光标记。

应用

活体成像是生物正交化学生物正交化学应用最多的领域，其次是药物开发和药物递送等。

聚糖成像上的应用

生物正交化学是了解聚糖结构、定位和生物功能的重要试验方法。糖代谢前体包括许多用于生物正交反应的化合物，如叠氮化物、末端炔烃和高张力炔烃。可借助适当的生物正交搭档化合物来观察聚糖，例如叠氮化物可以与含磷酯或硫代酸酯的化合物进行施陶丁格反应或无痕施陶丁格连接反应、末端炔烃或高张力炔烃则可以分别参与CuAAC或SPAAC反应。

活体标记与示踪中的应用

科学家们发展了基于代谢工程的生物正交化学修饰策略，该策略利用生物自身的生物合成和代谢机制，将独特的功能基团(生物正交化学功能基团）整合到目标生物分子中，从而实现在复杂的生物体内对目标分子的标记和研究。

在活细胞中，蛋白质、糖类和脂质都可以被生物正交基团修饰。通过化学合成的方法将生物正交基团连接到代谢类似物上，利用生物的代谢合成过程将生物正交基团引入细胞，随后用配对基团修饰的反应探针连接，可以实现对目标生物分子的标记或成像，进而分析细胞或目标生物分子的定位和重要功能。

利用代谢工程和生物正交反应，可以实现对病原微生物的活体示踪，有利于研究其致病机制。通过代谢工程和生物正交化学对细菌多糖进行标记，能够可视化地研究细菌的体内侵袭行为。由于病毒的蛋白质和核酸等分子均可被标记，将代谢工程与生物正交化学结合，可实现对病毒的无损代谢修饰，最终实现对病毒的实时跟踪或标记。

靶向传递中的应用

代谢工程可以在包括肿瘤细胞在内的各种细胞表面，人工引入生物正交功能基团作为化学受体，并且不受限于细胞的表型，这些人工化学受体可大量表达，用于生物正交标记、靶向识别和药物递送。生物正交化学反应已被应用于成像剂和抗肿瘤药物的组织靶向递送，具有很好的体内示踪和肿瘤靶向效果。生物正交化学反应还可用于免疫刺激物的传递，增强免疫治疗抗肿瘤的效果。

代谢标记技术能够将化学功能基团修饰到细菌等病原体的表面，基于代谢工程的生物正交化学可作为改善抗菌效果的有效措施。Mao等利用代谢标记和生物正交化学实现了对细菌的体内检测和治疗。

荧光成像

荧光成像是一种融合多门现代学科的显像方法，其运用荧光成像探针实现对细胞及动物体内的生物大分子的动态、可视化观察，为疾病的诊断与治疗提供了有力的方法。理想的荧光发色团和细胞环境友好的生物正交反应是构建性能优良的活细胞荧光成像探针的两大因素。有机小分子发色团因其结构容易修饰，因此应用最为广泛．通过修饰，基于香豆素、荧光素、罗丹明、BODIPY和箐染料已经发展出了一系列的荧光发色团，其大多水溶性和生物兼容性较好，波长和性能通过结构修饰可调，已经被广泛发展成各种类型的荧光探针并应用到对各种生物分子的成像之中。